Klíčové aspekty návrhu pro protokoly studie validace virové clearance produktů genové terapie

ICH Q5A(R2)-Mezinárodní nadace pro harmonizaci

ICH Q5A(R2) byl oficiálně přijat 1. listopadu 2023 a představuje hlavní mezinárodní dokument s pokyny pro hodnocení virové bezpečnosti. Ve srovnání s Q5A(R1) publikovaným v roce 1999, významné aktualizace ve verzi R2 zahrnují: nově přidanou kapitolu o hodnocení virové bezpečnosti v kontinuální výrobě (kapitola 7); posílená úloha hodnocení rizik jako základu strategií virové clearance; začlenění sekvenování nové{10}}generace (NGS) do úvah o detekci virů; a explicitní požadavky na hodnocení nových produktů a výrobních procesů. Q5A(R2) byl přijat regulačními orgány, včetně FDA, EMA a PMDA, a poskytuje jednotný technický rámec pro validaci virového clearance po celém světě.

NMPA-Čínský regulační systém

Regulační rámec NMPA pro virovou bezpečnost pokrývá několik úrovní:

Úroveň dokumentu	Název dokumentu	Rok vydání
Základní dokument	Technické pokyny pro odstraňování/inaktivaci virů z krevních produktů	2002
Základní dokument	Obecné zásady pro technickou revizi hodnocení virové bezpečnosti biologických tkání-produkty odvozené od eukaryotických buněk-exprimované produkty	2005
Pokyny pro-specifické produkty	Technické pokyny pro farmaceutický výzkum a hodnocení aplikací klinických zkoušek pro rekombinantní adeno{0}}vektor asociovaný s virem (rAAV)-založený na produkty genové terapie in vivo	2023
Pokyny pro-specifické produkty	Společné technické požadavky na farmaceutickou kvalitu vektoru rekombinantního adeno-asociovaného viru (rAAV)-In vivo produktů genové terapie pro žádosti o registraci	2025
Inovativní směrnice	Technické pokyny pro platformovou validaci procesů virové clearance pro klinické zkušební aplikace terapeutických rekombinantních proteinových produktů (zkouška)a	2024

a: Tato směrnice představuje první případ, kdy čínský regulační úřad stanovil systematické technické požadavky na platformovou validaci procesů virové clearance a je v souladu s duchem ICH Q5A(R2).

FDA a EMA-americké a evropské regulační požadavky

FDA v lednu 2024 formálně vydala průmyslový dokument s pokyny založený na ICH Q5A(R2). Kromě toho kapitola United States Pharmacopeia (USP)<1050.1>poskytuje doplňkové technické pokyny k návrhu, hodnocení a charakterizaci postupů virové clearance. FDA pořádá každé dva roky sympozium o likvidaci virů; sympozium v ​​roce 2023 se zabývalo špičkovými- tématy, jako jsou nové způsoby, kontinuální výroba, nová chromatografická média a adsorpční filtry. Mezi hlavní pokyny agentury EMA patří CPMP/BWP/268/95 (poznámka pro pokyny ke studiím validace virů: Návrh, přínos a interpretace studií ověřujících inaktivaci a odstranění virů) a EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Pokyny pro hodnocení biotechnologických virů pro bezpečnost virů). bylo harmonizováno s ICH Q5A(R2).

Identifikace zdrojů virové kontaminace

ICH Q5A(R2) zdůrazňuje, že návrh validace virové clearance by měl být založen na komplexním posouzení rizik. U produktů pro genovou terapii by se identifikace zdrojů virové kontaminace měla týkat následujících úrovní:

Úroveň buněčné banky: Endogenní viry (např. retrovirové částice) a latentně infekční viry potenciálně ukryté v substrátech produkčních buněk (např. HEK293, CHO, HeLa). Je známo, že buňky HEK293 obsahují endogenní sekvence Ad5 El a přibližně 900 bp fragment EBV a jsou schopné exprimovat replikačně{10}}kompetentní adenovirus; proto by tomuto riziku měla být při hodnocení rizik věnována zvláštní pozornost.

Úroveň pomocného viru: Produkce vektoru AAV obvykle využívá metody, jako je trojitá transfekce pomocí pomocných plazmidů, které s sebou nesou riziko generování replikačně -kompetentního adenoviru (RCA). Podobně balicí buňky používané při produkci lentivirových vektorů mohou generovat replikačně -kompetentní lentivirus (RCL).

Úroveň surovin: Náhodné viry mohou být zavlečeny prostřednictvím surovin používaných při výrobě, včetně buněčných kultivačních médií, krmiv a enzymů. Toto riziko je zvláště významné, když se používají složky živočišného původu (např. fetální hovězí sérum, roztoky štěpení trypsinem).

Rozdíly v riziku: Genová terapie vs. Tradiční rekombinantní proteiny

Riziková dimenze	Tradiční rekombinantní proteinové produkty	Produkty genové terapie
Virový zdroj	Endogenní viry z buněčné banky; náhodné viry	Viry buněčné banky; pomocné viry; replikační-kompetentní vektory (RCV/RCL); integrace hostitelského genomu
Buněčný substrát	CHO, NS0, Sp2/0 a další dobře-charakterizované buněčné linie	HEK293, HeLa, CHO atd.; některé buněčné linie jsou tumorigenního původu
Vlastnosti produktu	lék na bázi bílkovin-; dobře-definovaná struktura	virový vektor; představuje riziko pro biologickou bezpečnost
Strategie ověřování	Více{0}}krokové odstranění virů; důraz na validaci procesních kroků	Je vyžadována detekce RCV/RCL; ověření a testování jsou zásadní
Validace platformy	Použitelné pro zavedené procesy, jako je S/D, nízké pH, nanofiltrace	Omezená použitelnost kvůli rozmanitosti typů vektorů

Tabulka 1. Srovnání rizik virové bezpečnosti: Produkty genové terapie vs. produkty tradičních rekombinantních proteinů

Obecné zásady

Selekce indikátorového viru je ústředním prvkem při navrhování protokolů validace virové clearance. ICH Q5A(R2) vyžaduje, aby výběr indikátorového viru vycházel z posouzení rizik a zohledňoval následující faktory:

Význam viru pro substrát produkční buňky (relevantní virus)

Fyzikálně-chemické vlastnosti viru (obalený/neobalený-obal, DNA/RNA, rozsah velikostí)

Odolnost viru vůči fyzikálním/chemickým ošetřením

Detekovatelnost a biologická bezpečnost viru

U produktů genové terapie musí selekce indikátorového viru navíc vzít v úvahu: roli samotného vektorového viru jako „relevantního viru“; potenciální riziko kontaminace pomocným virem; a požadavky na detekci a ověřování virů s kompetencí replikace- (RCV/RCL).

Doporučený indikátor Virus Panel

Virus	Typ	Obálka	Genom	Velikost (nm)	Zdůvodnění výběru / Aplikace
MVM	Parvovirus	Žádný	ssDNA	18–26	Neobalený model; nejmenší velikost a nejvyšší odolnost; vhodné pro validaci nanofiltrací (obecně nelze použít pro vektorové produkty rAAV)
PPV	Parvovirus	Žádný	ssDNA	18–26	Neobalený model; běžně používaný indikátorový virus pro krevní produkty
Reo-3	Reovirus	Žádný	dsRNA	60–80	Neobalený model; střední velikost; vysoká fyzická stabilita
PRV	Herpesviridae	Ano	dsDNA	150–200	Obalený model; velká velikost; široký rozsah hostitelů
X-MuLV	Retrovirus	Ano	ssRNA	80–110	Obalený retrovirový model; vhodné pro buněčné substráty odvozené od CHO-
BVDV	Flaviviridae	Ano	ssRNA	40–60	Obalený model; používá se k hodnocení metod chemické inaktivace (HCV náhradní)
VSV	Rhabdoviridae	Ano	ssRNA	70	Obalený model; široká tolerance pH; vhodné pro ověření deaktivace nízkým-pH

Tabulka 2. Doporučený panel indikátorů virů pro validaci virové clearance produktů genové terapie

Zvláštní požadavky na produkty AAV Vector

U rekombinantních vektorových produktů AAV vyžadují technické pokyny NMPA pro farmaceutický výzkum a hodnocení aplikací klinických zkoušek pro produkty genové terapie rAAV vektor-založené na genové terapii in vivo pozornost při detekci replikačně-kompetentního AAV (rcAAV). rcAAV označuje AAV schopný autonomní replikace, která typicky vzniká homologní rekombinací mezi pomocným plazmidem a produktovým AAV genomem. Detekce rcAAV se obecně provádí pomocí infekčních testů nebo metod qPCR, prováděných odděleně na léčivé látce a purifikovaném produktu.

Stojí za zmínku, že následné purifikační procesy pro AAV vektorové produkty typicky zahrnují štěpení nukleázou, chromatografii (AEX), nanofiltraci a iontoměničovou chromatografii (CEX/IEX). Při tradiční validaci virové clearance mohou tyto procesní kroky vést k významným ztrátám samotného AAV vektoru; proto musí být interakce mezi vektorovými a indikátorovými viry pečlivě zvážena při návrhu zmenšeného-modelu. U určitých kroků procesu (např. nanofiltrace), kde jsou ztráty vektoru AAV značné, by se mělo vyhodnotit, zda jsou úpravy procesu opodstatněné na základě validačních dat (např. úprava velikosti pórů nanofiltrační membrány).

Obecné zásady

Model zmenšení-dolů (SDM) je základním nástrojem pro ověřování virové clearance; jeho design musí přesně reprezentovat účinnost výrobního procesu při odstraňování virů. ICH Q5A(R2), oddíl 6.2.2, výslovně vyžaduje, aby zmenšený-model zachoval soulad s výrobním procesem v klíčových parametrech. U produktů pro genovou terapii jsou při návrhu SDM zvláště důležité následující úvahy:

Reprezentativnost kritických parametrů procesu

Zmenšený-model by měl být konzistentní s výrobním procesem v následujících parametrech: chromatografické podmínky (složení pufru, pH, vodivost); poměr zatížení (hmotnostní poměr vektor/supernatantní protein); doba kontaktu a teplota; průtok/doba zdržení; čistota a složení produktu. U produktů AAV by se měl také konkrétně zabývat vliv distribuce velikosti vektorových částic a obsahu prázdné kapsidy na výkon nanofiltrace.

Požadavky na kvalifikaci modelu

ICH Q5A(R2) vyžaduje odpovídající kvalifikaci zmenšeného-modelu, včetně: porovnání atributů kvality produktu (např. čistota, výtěžnost, hustota); kvalifikace konzistence kritických parametrů procesu; a zajistit, aby zmenšený-model zachycoval variabilitu výrobního procesu. Pro chromatografické kroky by měla být stanovena konzistence profilu píku, eluce a promývání; u kroků nanofiltrace by měly být ověřeny účinky objemové kapacity a složení produktu.

Vzorec pro výpočet LRV

Hodnota log snížení (LRV) je základní metrikou pro měření účinnosti virové clearance. ICH Q5A(R2), oddíl 6.5, poskytuje podrobný popis metod výpočtu LRV a statistického zpracování. Základní vzorec pro výpočet LRV je: LRV=log₁₀(N₀/N), kde N₀ je počáteční titr viru po přidání viru a N je titr zbytkového viru po zpracování procesu. Když titr zbytkového viru klesne pod detekční limit testu, měly by být použity metody odhadu, jako je Poissonovo rozdělení (např. testování ve velkém-objemu).

Aplikace intervalů spolehlivosti

Jak ICH Q5A(R2), tak EMA CPMP/BWP/268/95 vyžadují posouzení intervalu spolehlivosti výsledků výpočtu LRV. Obvykle se používá 95% interval spolehlivosti.

Kritéria účinnosti

Podle Technických pokynů NMPA pro odstraňování/inaktivaci virů z krevních produktů snížení počtu virů větší nebo rovné 4 logaritmům naznačuje, že procesní krok je účinný pro odstranění/inaktivaci virů. Toto kritérium však není absolutní prahová hodnota a mělo by být vyhodnoceno holistickým způsobem spolu s křivkami kinetiky inaktivace, vědeckým zdůvodněním výběru indikátorového viru a celkovou správností návrhu validačního protokolu. U produktů pro genovou terapii je třeba věnovat zvláštní pozornost kumulativní kapacitě clearance ve všech krocích procesu, aby se zajistilo, že celkový profil virové bezpečnosti je na přijatelné úrovni.

Aplikace a výzvy nanofiltrace

Vir{0}}retenční filtrace (nanofiltrace) je kritickým krokem virové clearance při následné purifikaci produktů genové terapie. Typické virové-filtry mají velikost pórů přibližně 20 nm. Mechanismus virové clearance nanofiltrace je primárně založen na velikosti-exkluze a dokáže účinně odstranit většinu virů větších, než je velikost pórů membrány, včetně -neobalených malých parvovirů, jako jsou MVM a PPV.

Nanofiltrace pro produkty genové terapie však čelí jedinečným výzvám: velikost AAV vektorů (přibližně 20–26 nm) je podobná velikosti některých indikátorových virů (např. MVM, 18–26 nm), což může vést ke snížené obnově vektoru; prázdné kapsidy mohou ovlivnit filtrační tok a účinnost retence viru; viskozita vzorku se může významně zvýšit s koncentrací vektoru. Proto by návrh SDM pro validaci nanofiltrace měl plně zohledňovat účinky distribuce velikosti vektorových částic a obsahu prázdné kapsidy na filtrační výkon a podle potřeby by se mělo zvážit použití nanofiltračních membrán s větší velikostí pórů.

Vyhodnocení kroků chromatografie virové clearance

Iontoměničová chromatografie (IEX) je základním krokem v procesech čištění AAV produktu, typicky využívající nukleázové štěpení následované aniontově výměnnou chromatografií (AEX) k zachycení prázdných a defektních kapsid nebo kationtoměničovou chromatografii (CEX) pro jemné čištění plných kapsid. Mechanismy virové clearance v chromatografických krocích zahrnují vylučování velikosti, elektrostatické interakce, afinitní interakce a další faktory. Diskuze na FDA 2023 Viral Clearance Symposium zdůraznily, že účinnost virových clearance kroků chromatografie je ovlivněna mnoha faktory, včetně kapacity plnění, pH, vodivosti a cyklování pryskyřice; pro komplexní hodnocení by měl být přijat vícefaktorový ortogonální designový přístup.

Kontrola virové bezpečnosti v kontinuální výrobě

Nově přidaná kapitola 7 ICH Q5A(R2) stanoví specifické požadavky na hodnocení virové bezpečnosti v kontinuální výrobě. U produktů pro genovou terapii se kontinuální výroba stala důležitým směrem vývoje, ale také přináší nové výzvy v oblasti virové bezpečnosti. Strategie kontroly virové bezpečnosti v nepřetržité výrobě zahrnují: -inline bariérové ​​filtry proti virům jako kritická opatření pro zadržování; vhodný návrh doby zdržení a procesních toků; začlenění inaktivačních kroků s definovanými dobami zdržení; a vylepšenou aplikaci procesní analytické technologie (PAT) pro-monitorování kritických parametrů procesu v reálném čase.